设计 RNAi 实验

用于评估 RNAi 效应的检测中产生噪声或非特异性信号的原因与检测本身一样多种多样。对信噪比影响较大的一些最常见变量包括：

• 评估的细胞数量
• 抗体和/或底物等试剂的选择
• siRNA 递送或添加底物后的检测时间安排
• 靶向基因产物的转换速率
• siRNA 的有效性

样本在多孔培养板（尤其是 96 和 384 孔板）中的位置可对检测结果产生极强影响。这可能是对细胞生长的影响和检测本身的组合作用所致。[Malo N, Hanley JA, Cerquozzi S, Pelletier J, Nadon R Nature Biotechnology 24 (2): 167-175] 在典型的平板细胞检测中，Ambion 观察到外环和角孔中细胞生长和/或检测性能变异性显著更多。无论评估在相同日期还是在不同日期进行，板间的变异性程度不一定一致。可通过改善铺板技术和统计方法控制这种变异性，以对结果进行归一化。以下是消除或减轻平板位置对 RNAi 数据影响的建议：

• 如果您的通量要求允许使用较少样本/板，可考虑避免使用多孔板的所有边缘孔。而是仅将培养基或未转染（或未电穿孔）细胞上样至这些孔中。
• 在平板中适当放置重复样本，以便其数据可用于评估位置效应。例如，将平板分为四象限，在单个平板的不同象限中包括重复样本，或至少包括阳性和阴性对照品。或者，在几个多孔板的不同位置包括重复样本。
• 使用数学或统计方法以尽可能减少边缘效应。可能通过明确定义的阳性和阴性对照品的合适放置发现错误数据，或根据板内或板间的位置对数据进行归一化。还可以为重新检测或评估环孔数据设置单独的要求。

在建立细胞处理和培养程序时，甚至可考虑不确定的详细信息，如所用培养板、培养基批次、为便于分离而进行的胰蛋白酶处理时间安排和培养箱内的放置。当然，应尽可能减少更明显的参数（如细胞的传代数、收获以进行实验时的细胞汇合度以及细胞在分散时保持悬浮的方法）的变异性。

在建立细胞处理和培养程序时，甚至可考虑不确定的详细信息，如所用培养板、培养基批次、为便于分离而进行的胰蛋白酶处理时间安排和培养箱内的放置。当然，应尽可能减少更明显的参数（如细胞的传代数、收获以进行实验时的细胞汇合度以及细胞在分散时保持悬浮的方法）的变异性。

同样，进行检测的程序也应标准化。这包括所有试剂供应商、试剂体积、siRNA 递送的时间安排和条件以及检测性能。在可能的情况下，应使用相同批次的试剂（尤其是含有血清的试剂）。如果未对移液方法以及移液器、液体处理系统和数据采集设备的校准状态进行标准化，则它们可能影响变异性。

即使在每个步骤中均使用标准程序进行优化试验，仍需通过在检测的各步骤中包括阳性和阴性对照，继续监测实验结果是否高于预期变异性。最后，如有必要，考虑重新检测样本。