• 快速 - 在铺板时转染细胞（反向转染），节省一天时间
  • 可重现 - 产生一致的批间、板间和孔间结果
  • 通用 - 适用于多种细胞系
  • 高效 - siRNA 转染效率较高，因此可使用低 siRNA 浓度，以尽可能降低非特异性效应
  • 强效 - 在存在或不存在血清的情况下均具有低细胞毒性

简化转染方案

传统上，siRNA 转染是一个为期两天的程序，使优化过程相对缓慢。研究人员开发了 siPORT NeoFX 转染试剂以优化 siRNA 转染方案。siPORT NeoFX 脂质体制剂可用于在胰蛋白酶处理后立即高效转染贴壁细胞，不会增加细胞毒性。只需向稀释的 siRNA 中加入 siPORT NeoFX，孵育后形成转染复合物，向培养孔中加入复合物并覆盖细胞（图 1）。与传统的预铺板转染程序相比，这种名为“neofection”的新简化方案将为研究人员节省一整天的宝贵时间。即使在存在血清的情况下，转染复合物仍具有活性和稳定性，因此在转染后无需去除或更换培养基。从开始到完成，成功的基因沉默实验可在不到 24 小时内完成。这种简化的方案可适用于多种细胞和实验设计，包括高通量应用。


图 1.传统铺板转染与使用 siPORT™ NeoFX™ 的 Neofection 的比较

针对低浓度的 siRNA 进行了优化

最近的报告表明，100 nM 或更高浓度的 siRNA 可导致培养的哺乳动物细胞中的基因表达出现非特异性变化（脱靶效应）[1-3]。将用于转染的 siRNA 的量减至 1-20 nM 可较大限度地减少这些非特异性效应，同时仍可实现广泛的靶基因沉默 [3]。Ambion 科学家专门开发了 siPORT NeoFX 转染试剂，用于高效转染低浓度 siRNA。例如，只需将 0.1 nM siRNA（靶向 GAPDH）转染至 HeLa 细胞中，就可实现高水平的 siPORT NeoFX 介导的基因沉默 (> 80%)（图 2）。在 siPORT NeoFX 转染复合物中使用 3 和 10 nM siRNA，可在多种贴壁的人细胞系中观察到靶基因表达显著降低，包括 MCF-7（乳腺癌细胞）、SKOV3（卵巢癌细胞）、A549（肺癌细胞）、SKNAS（骨髓神经母细胞瘤细胞）和 BJ 细胞（原代包皮成纤维细胞）（未显示数据）。


图 2.使用低浓度 siRNA 实现高效转染。对 HeLa 细胞进行胰蛋白酶化处理并以 4 x 10 4 个细胞/mL 的浓度将其重悬于生长培养基中。使用化学合成的 GAPDH siRNA（0.03 nM 至 10 nM）或阴性对照 siRNA（未显示数据）和 0.5 µL siPORT™ NeoFX™ 转染试剂制备转染复合物。转染后 48 小时，收获细胞并通过实时 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 和 18S rRNA 水平。剩余 mRNA 百分比的计算方法为转染 GAPDH siRNA 的细胞中的 GAPDH mRNA 量除以转染阴性对照 siRNA 的细胞中的 GAPDH mRNA 量。根据 18S rRNA 信号对数据进行归一化。这些结果表明，siPORT NeoFX 即使在 siRNA 水平降低的情况下也能很好地发挥作用，这在消除基因沉默应用中的脱靶效应方面具有显著益处。

高 siRNA 转染效率和低细胞毒性

siPORT NeoFX 可实现高水平的 siRNA 转染和敲低效率，同时维持高水平的细胞活力。在代表性转染实验中，将 Cy™3 标记的 siRNA 成功递送至较高百分比的 HeLa 细胞中（图 3A）。此外，与其他市售转染试剂相比，siPORT NeoFX 维持了较高水平的细胞活力，同时在 HepG2 细胞中显示出较佳的基因沉默活性（图 3B）。


图 3.siPORT™ NeoFX™ 转染试剂的高效率和低细胞毒性。(A) 使用 siPORT NeoFX 转染试剂将 30 nM Cy™3 标记的 siRNA 转染至 HeLa 细胞中。随后固定细胞，用 DAPI 染色以显示细胞核，并通过荧光显微镜进行分析。蓝色：DAPI 染色的细胞核；红色：Cy3 荧光 siRNA。 (B) 按照生产商的说明，将 CDK2 siRNA 或 Silencer™ 阴性对照 siRNA #1 与 6 种不同转染试剂混合，并添加至 96 孔培养皿的空孔中（siRNA 最终浓度为 30 nM）。将 HepG2 细胞添加到孔中并在含有血清的完全培养基中培养 48 小时。使用 PCA 96 仪器和 Viacount™ 检测试剂 (Guava Technologies) 通过微流式细胞术分析细胞活力。分离 RNA，通过实时 RT-PCR 定量测定靶基因表达。mRNA 水平的相对降低表示为转染阴性对照 siRNA 的细胞中表达的百分比。通过实时 RT-PCR 测量 18S rRNA 水平，以此对重复样本进行归一化。归一化基因表达的范围用误差线显示。

批间、日间、板间和孔间的性能一致性

除了高效 siRNA 转染和低细胞毒性外，预计良好的转染试剂还可在重复样本的多个孔之间以及不同批次的转染试剂之间可靠地提供高性能。这些特性对于在 96 孔板中排列的 siRNA 文库的高通量筛选尤其重要。如图 4 所示，当在两个不同日期进行的实验中使用 siPORT NeoFX 时，多孔和多板之间的基因沉默效率差异可忽略不计。此外，发现三个不同批次的 siPORT NeoFX 可提供一致的敲低效率（未显示数据）。


图 4.一致的日间、板间和孔间性能。使用 siPORT™ NeoFX™（0.3 µL/100 µL 反应体积）和 GAPDH siRNA (10 nM) 或加扰阴性对照 siRNA 在 96 孔板中转染 8,000 个 HeLa 细胞。按照图 2 所述定量测定剩余 GAPDH 表达。每一条柱代表八个重复孔的平均值。siPORT NeoFX 在多孔、多板和多天之间表现出一致的转染性能。

siRNA 递送解决方案

尽管 RNAi 领域发展时间较短，但已证明 RNAi 的使用在理解基因功能、阐明生物通路以及识别和验证潜在药物靶标方面具有巨大潜力。Ambion 致力于为研究人员提供出色的 siRNA 递送解决方案。Ambion 的转染和电穿孔产品系列可提供一致和可靠的性能。siPORT NeoFX 转染试剂的独特之处在于，它可在将细胞接种到培养皿期间使用，从而简化了转染方案，并将程序时间缩短一整天。