RNA 干扰是双链 RNA 通过靶向互补 mRNA 进行降解来诱导基因沉默的生物机制，正在不断革新研究人员研究基因功能的方式。在 RNA 干扰实验中验证基因敲低的有效方法是使用高效 siRNA，并利用实时荧光定量 PCR 监测 mRNA 水平的降低。本文阐述了如何结合使用 Ambion 的 Silencer siRNA 和 Applied Biosystems 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒生成高质量、准确且可重现的数据。

快速准确的基因沉默

使用靶向 52 种激酶转录本的 Silencer siRNA 转染 HeLa 细胞，并使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒测定处理后剩余的 mRNA 敲低水平。图 1 中的数据表明，71% 的转录本导致 80% 或以上的 mRNA 敲低水平，总体 > 92% 的 siRNA 导致转录本水平显著降低。重复实验之间的标准差在敲低的 10% 范围内。TaqMan 基因表达检测试剂盒探针相对于 siRNA 位置的位置不会显著影响敲低测量。


图 1.根据通过 TaqMan 基因表达检测试剂盒进行的测定， Silencer siRNA 诱导 mRNA 敲低，效率 > 80%。在 96 孔板中，使用靶向来自 Silencer 激酶 siRNA 文库的 52 种人类转录本的 siRNA (100 nM) 转染 HeLa 细胞。转染后 48 h，分离总 RNA 并转化为 cDNA。包括两种阳性对照 siRNA 和一种非靶阴性对照 siRNA。对设计用于相同转录本的三种 siRNA 均进行了检测。每种 siRNA 一式三份转染。使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒采用实时荧光定量 PCR 评估 siRNA 处理后剩余的 mRNA 水平。此外，使用 18S rRNA 检测对所有样本中纯化的总 RNA 进行归一化。

完整解决方案

Ambion（Applied Biosystems 旗下公司）和 Applied Biosystems 将其产品系列结合，为进行基因沉默实验和验证结果提供了完整解决方案。Ambion 的 Silencer 预设计 siRNA（和文库）靶向 NCBI RefSeq 数据库中 > 98% 的所有人类、小鼠和大鼠基因，无需进行昂贵且耗时的 siRNA 验证（也提供其他基因组基因的 siRNA）。Applied Biosystems 提供适用于人类、小鼠、大鼠和其他基因组中 > 785,000 种基因的 TaqMan 基因表达检测试剂盒。这些检测试剂盒可与 TaqMan 通用 PCR 预混液和 Applied Biosystems 7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统配合使用，从而提供完整的验证解决方案。