根据 Elbashir 等人 (1) 于 2001 年发表的描述在哺乳动物细胞中使用小干扰 RNA (siRNA) 的开创性文章,人们认识到,可将 RNA 干扰 (RNAi) 用作进行哺乳动物基因功能研究的一般工具。在不到两年的时间里,siRNA 已经成为许多研究项目的基石。siRNA 得以快速应用的主要原因是其易于使用,并且这种应用非常需要一种方法来减少哺乳动物细胞中单一基因的表达,以建立基因同一性与基因功能之间的联系。下文中提供了一些在哺乳动物系统中使用 RNAi 的更为重要的应用和文献中这些应用的示例。

基因功能检测假设

用于鉴定差异表达基因的阵列分析和其他方法已创建了庞大的基因和相关表型数据库。在很多情况下,科学家们可根据不同样本中的表达模式来预测基因功能。使用果蝇、秀丽隐杆线虫和酿酒酵母等模型生物体中功能已知的基因进行同源性搜索,开发有关哺乳动物基因功能的其他预测功能。在很多情况下,可使用 siRNA 检测这些预测的准确性。

* Al-Khalili 等人 (2) 用血清处理了肌小管,结果显示葡萄糖摄取量增加与细胞表面葡萄糖转运体 (GLUT1) 含量增加相关。为了证实葡萄糖转运取决于 GLUT1 表达,使用 GLUT1 siRNA 处理细胞,结果显示血清刺激葡萄糖运输水平有所降低。

* 在另一份报告中,Chen 和 Barritt (3) 使用 siRNA 研究了经典瞬时受体电位 1 (TRPC1) 基因。TRPC1 基因被视为可编码通过去除细胞储存和/或细胞内信使而激活的非选择性阳离子通道。当用 TRPC1 siRNA 处理肝细胞时,这些细胞显示在低渗溶液中细胞体积有所增大,Ca2+、Mn2+ 和 ATP 流入有所减少,支持该假设。

靶标验证

有关 siRNA 的许多成就归因于其可几乎无缝整合至治疗开发过程。最简单的形式是,药物开发遵循以下路径:靶标鉴定 -> 靶标验证 -> 治疗化合物开发 -> 模型系统中的化合物检测 -> 临床试验。因为 siRNA 易于使用且特异性高,所以其可为验证研究提供极佳的工具。可减少潜在治疗靶标的表达并确定所需的表型结果是否能够可靠地证明相同靶基因的抑制剂有治疗价值。

* Filleur 等人 (4) 的研究结果表明,抗血管生成分子凝血酶敏感蛋白-1 (TSP-1) 可能会减少血管化并延迟肿瘤发生。随着时间的推移,产生活性 TSP1 的肿瘤细胞开始形成呈指数生长的肿瘤。这些肿瘤由分泌极大量血管生成刺激物血管内皮生长因子(VEGF,足以克服抑制性 TSP1 的作用)的细胞组成。联合使用 TSP1 和 VEGF 特异性 siRNA 处理肿瘤细胞可显著降低细胞增殖。该结果表明,联合使用 TSP1 和抗 VEGF 化合物可减缓或消除肿瘤生长。

* 根据脂肪酸合成酶 (FASE) 在人上皮细胞中过表达这一观察结果,De Schrijver 等人 (5) 认为该基因是可用于抗肿瘤治疗的一个感兴趣靶标。研究人员使用 siRNA 以减少前列腺淋巴结癌 (LNCaP) 细胞中的 FASE 表达。FASE siRNA 在 LNCaP 细胞中引发了多个表型,包括细胞凋亡诱导。有趣的是,FASE siRNA 对培养的非恶性皮肤成纤维细胞的生长速率或活力没有影响。这些数据指出了选择性抑制 FASE 的癌症药物的潜力。

* 细胞周期蛋白 E 在许多肿瘤细胞中过表达。为了确定基因作为药物靶标的潜在价值,Li 等人 (6) 使用 siRNA 减少了肝细胞癌 (HCC) 细胞中的细胞周期蛋白 E 表达。与预期的情况一致,细胞周期蛋白 E siRNA 促进了 HCC 细胞的凋亡并阻断了细胞增殖。此外,细胞周期蛋白 E siRNA 抑制了裸小鼠 HCC 肿瘤的生长,证明有可能创造出可靶向细胞周期蛋白 E 的药物。

通路分析

siRNA 的另一个关键应用是通路分析。减少单基因的表达会影响相同通路的基因的表达和活性。例如,降低转录因子(如 p53)的水平将减少依赖 p53 转录因子以获得活性的任何基因的表达。此外,由 p53 控制的基因产物调节的基因表达也会受到影响。用靶向给定基因的 siRNA 处理细胞,然后使用微阵列监测其他基因的表达,就可以鉴定与靶基因相关的基因。此外,可使用靶向通路中的多个基因的 siRNA 依次处理细胞并检测哪些基因受到影响,从而分离特定途径。这样即可在通路中为每一个基因分配一个位点。

* Ramos-Nino 等人 (7) 将 RPM 细胞暴露于青石棉,并使用阵列监测基因表达。根据基因的反应对其进行分类。高度快速上调的基因包括原致癌基因 fra-1。siRNA 诱导的 fra-1 表达减少导致 cd44 和 c-Met 的表达增加,可将 fra-1 与调节间皮瘤细胞运动和侵袭的基因连接起来。

基因冗余

在许多情况下,能够耐受在高等真核生物中消除某一单基因的表达,即使该基因产物在关键通路中发挥作用时也是如此。这是因为许多关键的细胞功能是通过一个以上的基因产物实现的。当一个基因产物被消除时,冗余基因产物可进行补偿,以使细胞或动物继续存活。可以通过共转染 siRNA 和检测给定表型来鉴定冗余基因。例如,被鉴定为在细胞周期调节中发挥重要作用的基因可能无法引发细胞周期缺陷表型。将此 siRNA 与靶向其他细胞周期基因的其他 siRNA 进行共转染并检测细胞周期表型,可鉴定在细胞周期中相同时间点起作用的基因。为确保每个候选基因仅在与靶基因结合减少时导致细胞周期缺陷,对候选基因进行单独评估,这有助于确定最可能的冗余基因。

* 人们认为葡萄糖水平由 Akt 丝氨酸/苏氨酸激酶家族调节。当 Katome 等人 (8) 使用 siRNA 减少了 Akt2 的表达时,他们注意到细胞葡萄糖调节略有变化。然而,当他们靶向 Akt 基因的两种同源异构体(Akt1 和 Akt2)时,他们注意到葡萄糖调节出现显著变化。采用同源异构体特异性 siRNA 的实验最终证明,在两种不同细胞系中,Akt2 和 Akt1(作用较小)在胰岛素刺激的 GLUT4 易位和葡萄糖摄取中起着至关重要的作用,而 Akt1 和 Akt2 在胰岛素刺激的糖原合成中具有同等作用。 

功能筛选

靶向广泛基因集合的 siRNA 文库将使筛选实验能够将基因与细胞功能联系起来。迄今为止,仅一些大型研究组织才拥有含超过几百种 siRNA 的文库。Ambion 认识到 siRNA 文库的益处,正在制备含超过 1800 种靶向已知人激酶的 siRNA 的集合。尚无关于 siRNA 文库在筛选实验中的应用的已发表报告,但在果蝇和秀丽隐杆线虫中使用 dsRNA 文库的筛选举例说明了这些机会。

已在秀丽隐杆线虫中使用靶向 10,000 多个基因的 RNAi 文库,以鉴定调节脂肪 (9)、预期寿命 (10) 和突变控制 (11) 的基因。用于果蝇的类似 RNAi 文库已用于鉴定负责调节唐氏综合征细胞黏附分子磷酸化的基因 (12)。在每一个筛选应用中,实验的关键是稳健的表型检测和高质量的 RNAi 文库。

siRNA 作为治疗剂:下一个前沿领域

虽然许多研究人员正在其药物开发过程中利用 siRNA,但一些科学家正在将 siRNA 作为治疗剂进行评估(综述见 13)。如果认识到这一点,siRNA 可以靶向几乎任何基因,以进行治疗干预。研究人员已经证明,RNAi 通路在小鼠中具有活性,并且 siRNA 在几种不同的组织中分别具有耐受性和有效性 (14)。合成的 siRNA 和 siRNA 表达载体(质粒和病毒)已被系统性注射到确定的组织中,并引发靶标特异性应答。许多出版物表明,siRNA 可抑制 HIV (15,16) 和乙型肝炎病毒 (17) 的复制。此外,靶向朊病毒易感蛋白的 siRNA 能够抑制细胞中的朊病毒形成,从而可设计出一种针对朊病毒疾病的替代治疗方法 (18)。

随着 RNAi 领域的不断发展(正在进入动物模型、治疗和药物发明以及靶向相关领域),Ambion 将继续开发创新型产品,这些产品可利用 RNAi 的强大功能开展基础、应用和治疗研究工作。 

参考文献

  1. S M Elbashir, J Harborth, W Lendeckel, A Yalcin, Klaus Weber, T Tuschl (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture.Nature 411: 494­498.

  2. Al-Khalili L, Cartee GD, Krook A (2003) RNA interference-mediated reduction in GLUT1 inhibits serum-induced glucose transport in primary human skeletal muscle cells.Biochem Biophys Res Commun.307(1): 127­32.

  3. Chen J, Barritt GJ.(2003) Evidence that TRPC1 (transient receptor potential canonical 1) forms a Ca(2+)-permeable channel linked to the regulation of cell volume in liver cells obtained using small interfering RNA targeted against TRPC1.Biochem J. 373(Pt 2): 327­36

  4. Filleur S, Courtin A, Ait-Si-Ali S, Guglielmi J, Merle C, Harel-Bellan A, Clezardin P, Cabon F (2003) siRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-1 and slows tumor vascularization and growth.Cancer Res.63(14): 3919­22.

  5. De Schrijver E, Brusselmans K, Heyns W, Verhoeven G, Swinnen JV (2003) RNA interference-mediated silencing of the fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cells.Cancer Res.63(13): 3799­804.

  6. Li K, Lin SY, Brunicardi FC, Seu P. (2003) Use of RNA interference to target cyclin E-overexpressing hepatocellular carcinoma Cancer Res.63(13): 3593­7.

  7. Ramos-Nino ME, Scapoli L, Martinelli M, Land S, Mossman BT (2003) Microarray analysis and RNA silencing link fra-1 to cd44 and c-met expression in mesothelioma.Cancer Res.63(13): 3539­45.

  8. Katome T, Obata T, Matsushima R, Masuyama N, Cantley LC, Gotoh Y, Kishi K, Shiota H, Ebina Y (2003) Use of RNA interference-mediated gene silencing and adenoviral overexpression to elucidate the roles of AKT/protein kinase B isoforms in insulin actions.J Biol Chem.25;278(30): 28312­23.

  9. Ashrafi K, Chang FY, Watts JL, Fraser AG, Kamath RS, Ahringer J, Ruvkun G (2003) Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes.Nature.421(6920): 268­72.

  10. Lee SS, Lee RY, Fraser AG, Kamath RS, Ahringer J, Ruvkun G (2003) A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.Nat Genet.33(1): 40­8.

  11. Pothof J, Van Haaften G, Thijssen K, Kamath RS, Fraser AG, Ahringer J, Plasterk RH, Tijsterman M (2003) Identification of genes that protect the C. elegans genome against mutations by genome-wide RNAi.Genes Dev.15;17(4): 443­8.

  12. Muda M, Worby CA, Simonson-Leff N, Clemens JC, Dixon JE (2002) Use of double-stranded RNA-mediated interference to determine the substrates of protein tyrosine kinases and phosphatases.Biochem J. 366(Pt 1): 73­7.

  13. Caplen NJ (2003) RNAi as a gene therapy approach.Expert Opin Biol Ther.3(4): 575­86.

  14. McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, Conklin DS, Hannon GJ, Kay MA (2002) RNA interference in adult mice.Nature 418(6893): 38­39.

  15. Song E, Lee SK, Dykxhoorn DM, Novina C, Zhang D, Crawford K, Cerny J, Sharp PA, Lieberman J, Manjunath N, Shankar P (2003) Sustained small interfering RNA-mediated human immunodeficiency virus type 1 inhibition in primary macrophages.J Virol.77(13): 7174­81.

  16. Banerjea A, Li MJ, Bauer G, Remling L, Lee NS, Rossi J, Akkina R (2003) Inhibition of HIV-1 by lentiviral vector-transduced siRNAs in T lymphocytes differentiated in SCID-hu mice and CD34+ progenitor cell-derived macrophages.Mol Ther.8(1): 62­71.

  17. Klein C, Bock CT, Wedemeyer H, Wustefeld T, Locarnini S, Dienes HP, Kubicka S, Manns MP, Trautwein C (2003) Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA.Gastroenterology.125(1): 9­18.

  18. Daude N, Marella M, Chabry J (2003) Specific inhibition of pathological prion protein accumulation by small interfering RNAs.J Cell Sci.116: 2775­9.