适当的阳性和阴性对照在生物学实验中始终至关重要

这一点对于使用siRNA的RNA干扰实验来说毋庸置疑。针对本文，我们特地向Applied Biosystems研发人员询问了关于如何在siRNA对照实验中合理使用对照的建议。以下是他们的建议。

良好的转染对于使用siRNA有效敲低靶标来说绝对不可或缺。因此在每个实验中使用阳性对照至关重要。阳性对照siRNA应能够在您研究所用的细胞中产生可重复、易检测的敲低效应。只要您发现该对照产生了最大敲低作用，即可确定同一天其他siRNA测试的敲低测量值也是可靠的。

图1所示数据表明，在实验中使用阳性对照的作用以及了解什么水平的敲低代表“良好”转染的重要性。该实验使用了GAPDH的siRNA，当其被有效转染到HeLa细胞中时，通常可敲低≥97%的靶标（剩余基因表达≤3%）。图1中的数据表明，来自相同实验的敲低作用可在两天中重复。例如，如灰色线条所示，转染未达到最佳效果：GAPDH阳性对照siRNA具有约8%的剩余表达（敲低92%）。请注意，当GAPDH对照siRNA只产生92%的敲低时，实验中的其他siRNA性能不佳。如果我们不知道该对照能够敲低≥97%的靶标，我们可能会错误地认为该实验的转染效果很好，而事实是39个siRNA中只有24个得到了≥70%的敲低效率——这是一个相当低的成功率！在第二个实验中使用完全相同的siRNA，GAPDH对照siRNA产生了>97%的敲低结果（图1，绿色线条）。同样，在所有其他siRNA中，只有一种siRNA的靶标敲低率未达到70%。

图1. 敲低数据表明使用阳性对照监测转染效率的重要性。使用指定的Ambion Silencer Select siRNA进行转染，随后使用TaqMan实时荧光定量PCR检测剩余基因表达。以非靶向siRNA阴性对照转染细胞的表达为基础，对结果进行归一化处理。该实验重复进行2次，如灰色线条和绿色线条所示。应注意，若GAPDH siRNA对照实验的敲低效果较差，则其余siRNA的敲低效率低于被认为有效的阈值，约为20%-30%。在其他实例中（绿色线条），GAPDH的敲低效率在预期范围内（>97%），表明转染具有高效率，其他siRNA的敲低效果也足以产生有意义的结果。

理论上，在siRNA对照实验中，荧光染料标记的siRNA应具有理想的转染对照：仅转染，然后测定内部含有荧光染料的细胞百分比。但是，在实际情况中，可观察到的荧光标记siRNA摄入与相应靶标敲低之间的相关性具有相当大的变异性。由于存在这种可观察到的变异性，我们建议使用未标记的siRNA作为转染的阳性对照。

许多阳性对照靶标都具有简单、灵敏的蛋白检测方法，siRNA敲低实验的最终目标是降低靶蛋白表达量。因此，研究人员有时会质疑，通过测量目标mRNA或相应蛋白质产物的减少来评估阳性对照转染是否更好。

由于siRNA在mRNA水平上发挥其作用，所以测量目标mRNA的敲低效果是更为直接的方法。我们建议使用 aqMan基因表达检测和TaqMan基因表达预混液评估mRNA敲低，以获得稳定、可靠的结果。在使用培养细胞的实验中，使用 TaqMan Gene Expression Cells-to-CT™ 试剂盒（包含预混液）能够在未分离RNA的细胞裂解液中直接进行实时RT-PCR检测。

在RNAi实验中，阴性对照和阳性对照对于获得有意义的数据来说同等重要。在所有实验中，使用至少一种等量的非靶向siRNA阴性对照进行转染——所得数据可作为评估实验靶标敲低的基线。例如，图1所示数据已经进行了归一化处理，其基线为使用非靶向siRNA阴性对照进行转染的细胞内指定靶标的表达量，在该例中，阴性对照为 Ambion Silencer Select 1号阴性对照siRNA。

未转染或仅细胞的阴性对照在siRNA实验中也非常实用。通过对比未转染培养物和使用非靶向阴性对照siRNA转染的培养物中的管家基因表达，可获得关于转染对细胞活力的影响的重要信息。

科学贡献者：
Rajeev Varma, Susan Magdaleno • Applied Biosystems Inc., Austin, TX