制备 siRNA 实验用质粒的第一步是鉴定感兴趣基因中易发生 siRNA 诱导降解的靶序列。我们发现，略超一半的 siRNA 可使靶标 mRNA 水平降低至少 50%，约 1/4 的 siRNA 可使该水平降低 75%-95%。一般过程从扫描靶基因的长度开始，以寻找潜在 siRNA 靶点。对于 siRNA 表达载体，靶点应具有 5' 末端 AA，因为折叠时 siRNA 发夹结构可形成 UU 突出端。因此，这些 UU 突出端将与靶点中的 AA 互补。然后将含 21 个核苷酸的 siRNA 靶序列与合适的基因组数据库进行比较，以消除与其他基因具有显著同源性的序列。在筛选过程中，我们通常针对每个靶标检测四种 siRNA。我们使 siRNA 短于基因序列长度，以减少靶向高度结构化或与调节蛋白结合的 mRNA 区域的可能性。

针对每个靶标构建四种 siRNA 表达质粒可能既费时又昂贵。体外转录是一种困难程度较小的 siRNA 筛选方法。为确保从质粒表达的 siRNA 在功能上与通过体外转录制备的 siRNA 相当，我们制备了靶向亲环蛋白和 GAPDH 基因中的四种不同序列的质粒和 siRNA。将这些核酸转染至 HeLa 细胞中。使用 GAPDH、亲环蛋白和 28S rRNA 特异性探针通过 Northern 分析评估沉默情况。通过磷光成像仪对来自多种靶标的杂交信号进行定量测定。对于体外制备的 siRNA 和 RNA Pol III 表达的 siRNA，siRNA 靶点对 siRNA 介导的基因沉默的敏感性似乎相当。对于化学合成的 siRNA 和 RNA Pol III 表达的 siRNA，也是如此。因此，无需重新筛选已鉴定出功能性 siRNA 的基因。