Ambion 与 Applied Biosystems 合作为基因沉默实验提供了完整、便利的解决方案，并通过实时 RT-PCR 对结果进行了验证。Ambion 的 Silencer™ 经验证和 Silencer 预设计 siRNA 消除了与 siRNA 设计和测试相关的猜测和繁琐工作。Applied Biosystems 的基因特异性、即用型 TaqMan 基因表达检测试剂盒提供了一种用于检测 mRNA 敲低效果的快速、简单的方法。
siRNA 实验的最终目标是确定基因功能、分析生物通路或验证潜在的药物靶标。但在实现这一目标之前，必须使用优化的方案设计和合成 siRNA 并将其递送至细胞，然后证明其有效性。最后，需要将任何诱导的表型变化与 siRNA 诱导的敲低程度相关联。

Ambion 的 Silencer™ 预设计 siRNA 适用于 NCBI RefSeq 数据库中的 > 34,000 个人类、小鼠和大鼠基因，可省去昂贵且耗时的 siRNA 设计、合成和测试步骤。同样，Applied Biosystems 提供的 TaqMan 基因表达检测试剂盒还可通过实时荧光定量 PCR 对 > 41,000 个人类、小鼠和大鼠基因进行定量基因表达分析。这些检测方法可用于测量 mRNA 敲低效果进行 siRNA 验证、优化转染以及将表型与特定 siRNA 诱导的基因敲低程度相关联。

监测基因特异性 siRNA 效果的检测方法

siRNA 在 mRNA 水平发挥作用。因此，用于 siRNA 验证和转染优化的首选检测方法是定量测定靶标 mRNA 水平的方法。一旦完成这些初步研究，就可以测量靶标 mRNA 及相应蛋白水平，从而将表型变化（通过酶促试验、细胞试验、基因表达谱分析或其他方法进行监测）与 siRNA 诱导的敲低程度相关联。

TaqMan 基因表达检测试剂盒的优势

qRT-PCR 在 RNAi 实验中监测靶标 mRNA 水平方面具有以下几个优势。它的灵敏度是 Northern 分析的数千倍，可更快地获得结果（仅需数小时即可完成检测），且该方法可提供定量结果。与 Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测试剂盒（针对 > 21,000 个人类、> 14,000 个小鼠和 > 4,000 个大鼠基因的现成、预设计和预优化引物探针集）配合使用时，该方法不需要优化。这使得实时荧光定量 PCR 比 Northern 分析更容易进行、获得的数据重现性更好且信号差异更小。

siRNA 验证

基因沉默实验需要有效敲低靶基因表达的 siRNA。为了证明特定 siRNA 序列是有效的，需要在细胞中对 siRNA 进行功能性测试，并证实或“验证”该 siRNA 可将靶标 mRNA 水平降低预定的量。对于使用特定 siRNA 设计算法设计的大量 siRNA，也需要进行功能性测试，以证明用于设计 siRNA 的算法能够准确预测有效的 siRNA。

Ambion 和合作伙伴 Cenix BioScience 选择使用 qRT-PCR 测试 Ambion 的 Silencer 经验证 siRNA，并对超过 1100 种 siRNA 进行系统性验证，从而确认 Cenix 的 siRNA 设计算法的有效性（使用该算法设计了 Ambion 的所有 Silencer 经验证和预设计 siRNA；参见“siRNA 设计：一切都在算法中”）。图 1 描述了用于验证 siRNA 的工作流程。使用该方法，确定将靶标 mRNA 水平降低 70% 或以上的 siRNA 被视为“经验证”的 siRNA，随后作为 Silencer 经验证 siRNA 提供。图 2 显示了在 Ambion 使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒定量测定靶标 mRNA 水平生成的一小部分验证数据。


图 1.Ambion 的 Silencer™ 经验证 siRNA 的验证。Cenix 和 Ambion 均使用以下程序来对 siRNA 进行验证：

1) 将细胞铺到 96 孔板上，生长 24 小时。
2) 基因特异性 siRNA 和阴性对照 siRNA 分别进行三次平行转染。
3) 48 小时后，提取 RNA。
4) 通过实时荧光定量 PCR 定量测定靶标 mRNA 水平。
5) 使用 18S rRNA 水平对数据进行归一化。
6) 靶基因敲低的程度表示为用基因特异性 siRNA 处理的细胞中剩余的 mRNA 相较于用阴性对照 siRNA（Silencer 阴性对照 siRNA #1）处理的细胞中的 mRNA 的百分比。



图 2.使用 Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测试剂盒生成的 Silencer™ siRNA 验证数据。将指定的 30 nM Silencer 经验证 siRNA 转染至 HeLa 细胞中。48 小时后分离 RNA，并使用适当的 TaqMan 基因表达检测试剂盒通过一步法 qRT-PCR 进行分析（使用 18S rRNA 的实时数据对输入的 RNA 量的结果进行归一化）。插图显示，与转染相等浓度的 Silencer 阴性对照 #1 的细胞相比，靶基因表达水平降低。

优化 siRNA 转染

在进行 siRNA 实验以研究基因功能、分析生物通路或验证药物靶标之前，必须对优化的 siRNA 递送条件进行鉴别和/或确认。测试、优化和验证 siRNA 转染或电穿孔条件的最佳方法是使用针对合适靶标的高效、经验证的 siRNA，并监测通过递送 siRNA 诱导的 mRNA 水平的降低情况。Ambion 采用 qRT-PCR 作为所选方法，并且 Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测试剂盒可为此提供经验证且易于使用的引物探针集（图 3 和图 4）。

Silencer GAPDH siRNA 对照和针对 GAPDH 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒分别提供了理想的对照 siRNA 和优化转染的检测方法（图 4）。

图 3.siRNA 转染优化流程概述。


图 4.使用 qRT-PCR 优化 siRNA 转染。使用 CDK2 siRNA 或阴性对照 siRNA 对 Cos-7 细胞进行转染，每孔加入指定体积的转染试剂。转染后 48 小时收获细胞，并使用针对 CDK2 和 18S rRNA 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒通过实时 RT-PCR 进行分析。使用来自 18S rRNA 反应的数据对输入的 RNA 进行归一化，并通过与阴性对照 siRNA 的基因表达量进行比较来计算 CDK2 表达百分比。

将表型与敲低程度相关联

为了更好地评估功能性 siRNA 实验结果，应将引发的表型与特定 siRNA 诱导的敲低程度相关联。为了得到全面信息，应对靶标 mRNA 水平和相应的蛋白水平进行分析。蛋白水平可通过 Western 印迹、免疫荧光、ELISA 或其他方法进行监测。（可使用 Ambion 的 PARIS™ 试剂盒分离蛋白。）然而，qRT-PCR 仍是定量测定 mRNA 水平的首选方法。

siRNA 的表型效应与诱导的 mRNA 敲低程度相关联的示例见图 5。将靶向存活素 mRNA 的 Silencer 经验证 siRNA 转染至细胞中。将 Silencer 阴性对照 #1 siRNA 转染至另一组细胞中。使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒进行的 qRT-PCR 显示，与阴性对照 siRNA 处理的细胞相比，存活素 siRNA 使这些细胞中的存活素 mRNA 水平降低 80%（图 5）。此外，对存活素蛋白水平进行的免疫荧光分析表明，与阴性对照 siRNA 转染的细胞相比，蛋白水平降低 76%（未显示数据）。在存活素 siRNA 处理的样本中，观察到细胞核形态的明显变化，与经历细胞凋亡的细胞的预期变化一致。与未转染细胞相比，在用阴性对照 siRNA 处理的细胞中未观察到明显的细胞核形态变化。从这些数据可以推断，存活素的敲低在这些样本中诱导了细胞凋亡。下一个实验步骤是用另一种靶向存活素的 siRNA 确认结果，并通过其他检测方法（如半胱天冬酶活性检测、膜联蛋白 V 检测等）监测细胞凋亡，同时继续通过 qRT-PCR 监测存活素 mRNA 的敲低程度。

图 5.使用 Silencer™ 经验证 siRNA 敲低存活素并使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒进行验证。用 30 nM 靶向存活素 (BIRC5) 的 Silencer 经验证 siRNA 或 Silencer 阴性对照 #1 转染 HeLa 细胞，每种 siRNA 设置四组平行样。48 小时后，使用 DAPI 对两组样本进行染色，并通过荧光显微镜进行分析。用 RNAqueous MAG-96 从其他两组样本中分离总 RNA，然后转化为 cDNA。使用针对存活素的 TaqMan 基因表达检测试剂盒 (Hs00153353_m1) 对靶标 cDNA 水平进行两次重复分析。此处显示的数据表示来自单次转染的两次重复检测结果。与对照 siRNA 处理的细胞相比，存活素 siRNA 处理的细胞中的存活素 mRNA 水平降低 80%。存活素敲低诱导了细胞核的形态变化。插图显示了存活素和对照 siRNA 处理样本的代表性细胞。

总结

借助先进的生物信息学和设计算法获得了优化的 siRNA 和实时检测设计，使基因沉默实验比以往更容易进行。预设计 siRNA 和 qRT-PCR 检测组合通过 Ambion 网站进行链接。siRNA 数据库提供了有关靶向 NCBI RefSeq 数据库中几乎所有人类、小鼠和大鼠基因的 Ambion Silencer 预设计 siRNA 的信息。siRNA 数据库也是获得 Silencer 经验证 siRNA 的渠道，后者经功能性验证可将靶标 mRNA 水平降低 > 70%。