转染效率低和细胞活力低是基因沉默实验不成功的最常见原因

通过仔细优化，例如选择合适的siRNA转染试剂、siRNA转染实验步骤和转染方法，可以在许多细胞类型中实现高水平的转染效率。针对特定细胞类型优化方案后，即可轻松完成可重现的 siRNA 筛选实验。 

小干扰 RNA (siRNA) 沉默基因表达的能力对于研究培养的哺乳动物细胞中的基因功能而言具有重要价值。通常，siRNA 实验的成败取决于siRNA转染实验步骤中的siRNA 递送。siRNA转染试剂 可用于进行常用的瞬时转染。然而，高效转染 siRNA 并不简单；因此，RNAi 在难转染的细胞类型中的实用性可能有限。

为了尽可能提高外源引入的 siRNA 的有效性，需要进行转染优化实验。如果未优化关键转染参数，可能导致在细胞培养物中检测不到 RNAi 效应。这些转染参数包括培养条件、转染试剂的选择和用量、细胞暴露于转染试剂的时间以及 siRNA 的数量和质量。细胞转染实验程序本身可能是一个关键因素。预铺板转染程序涉及预铺板细胞，这意味着允许细胞在转染前附着、复苏和生长 24 小时。在这里，我们证明了另一种称为反向转染 [1] 或 neofection [2] 的转染程序与传统的预铺板方法相比具有几个关键优势。反向转染涉及同时对细胞进行转染和铺板，与转染悬浮细胞所用的方法非常相似。这种方法更简单快速，因为它绕过了传统方法的几个siRNA转染实验步骤。本文总结了如何使用反向转染在培养细胞中尽可能提高 siRNA 的性能，并提供了有关优化 siRNA 转染参数的建议。

• 培养细胞的健康状况
• 转染方法
• 转染条件
• siRNA 的质量和数量

转染优化的目标是确定能够尽可能敲低基因，同时维持特定细胞类型可接受的活力水平的条件（参见边栏，两步优化方案）。

培养细胞的健康状况。
为了尽可能提高转染过程中的细胞活力，细胞在实验开始时必须是健康的，健康的细胞比保存不佳的细胞更容易转染。过于拥挤和稀疏的培养物不利于细胞健康。许多细胞都会发生表达谱变化，当它们受到培养条件的影响时，会对您的实验产生不利影响。通常，不应允许细胞覆盖其培养皿的整个表面区域。相反，细胞应占可用空间的 20% 至 80%。在细胞过度拥挤之前进行传代培养可尽可能减少连续细胞系的不稳定性，并降低实验间的变异性。细胞在培养过程中会逐渐发生变化，难以持续保持细胞的理想健康状况；因此，为了获得尽可能重现的实验结果，我们建议在优化实验的 10 次传代内转染细胞。超过此传代数的细胞应被销毁，并更换为冷冻库存中的新细胞。最后，坚持严格的方案（包括细胞铺板和转染之间的时间间隔）将提高实验重现性。

转染方法。
在为转染做准备时，贴壁的哺乳动物细胞已按传统方法预铺板至组织培养孔中，并允许在转染前附着、复苏和生长 24 小时。反向转染是另一种转染方法，其中细胞在悬浮液中转染（即，胰蛋白酶处理后和铺板前）。对于许多检测的细胞类型，该方法的转染效率与标准预铺板方法相等或更高，可节省该过程一整天的时间（图 1）。推测的原因为，暴露的细胞表面面积（而非转染复合物的数量）是传统贴壁转染的限制因素。反向转染被认为增加了细胞对转染复合物的暴露，从而提高了转染效率。

图 1.标准预铺板转染 vs. 使用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂的反向转染。哺乳动物贴壁细胞通常在转染前“预铺板”，使其在暴露于转染复合物前重新附着并恢复生长 24 小时（左侧）。反向转染或“neofection”涉及在细胞悬浮液中添加转染复合物（在铺板前），从而节省转染程序一整天的时间（右侧）。

图 2A 显示了七种不同哺乳动物细胞类型中 GAPDH siRNA 的反向转染。数据表明，反向转染可为多种细胞递送高水平的功能性 siRNA。某些细胞类型通过反向转染进行转染的效率高于传统方法。例如，HepG2 细胞传统上是一种难以转染的细胞系，但可进行非常好的反向转染（图 2B），可能是因为它们的密集生长模式导致细胞表面在附着于底物上后无法充分暴露于转染试剂。

图 2.不同细胞系的高效反向转染。(A) 七种不同哺乳动物细胞类型中 GAPDH siRNA (Silencer GAPDH siRNA, Ambion) 的反向转染。针对每种细胞系优化了 siPORT™ NeoFX™ (Ambion) 用量、siRNA 用量和细胞密度（未显示数据）。在转染后 48 小时，收获所有细胞并通过实时 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 水平。 (B) HepG2 和 HeLa 细胞均在铺板期间进行反向转染，并在使用靶向 GAPDH 的 siRNA (Silencer GAPDH siRNA, Ambion) 或阴性对照 siRNA（Silencer 阴性对照 #1 siRNA，Ambion）对细胞进行预铺板后进行转染。转染后 48 小时，通过实时 RT-PCR 测量 GAPDH 表达。基因表达百分比计算为 GAPDH siRNA 转染细胞相较于阴性对照 siRNA 转染细胞的 GAPDH 基因表达。

当细胞进行反向转染时，细胞密度成为不太关键的参数，几乎不需要优化。图 3A 证明，多种细胞浓度被高效反向转染，而传统的预铺板转染需要仔细优化细胞密度（图 3B）。此外，反向转染速度更快（可以节省一整天的时间），因为转染前无需对细胞进行铺板。由于这些基本优势，Ambion 科学家通常使用反向转染程序优化新细胞系的转染。

图 3.反向转染对细胞铺板密度产生更高的耐受性。(A) 在 96 孔板中，使用 10 nM 和 30 nM GAPDH siRNA (Silencer GAPDH siRNA, Ambion) 或阴性对照 siRNA（Silencer 阴性对照 #1 siRNA，Ambion），利用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂（0.3 µL/孔，Ambion）以指定细胞密度对 SKOv3 细胞进行反向转染。在转染后 48 小时，收获细胞并通过实时 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 和 18S rRNA 水平。剩余基因表达计算为 GAPDH siRNA 转染细胞与阴性对照 siRNA 转染细胞相比 GAPDH mRNA 的百分比。根据 18S rRNA 信号对数据进行归一化。 (B) 转染前 24 小时，以指定铺板密度在 24 孔培养皿中对 COS-7 细胞进行预铺板。使用 siPORT™ 胺转染试剂（4 µL/孔，Ambion），利用 10 nM GAPDH 或阴性对照 #1 siRNA 进行转染。按照检测组合 A 所述测定了剩余基因表达。

转染条件。
总体而言，转染效率和细胞活力取决于转染试剂的选择和用量以及细胞暴露于转染试剂的时间。市售试剂的有效性水平因细胞类型而异。细胞系与试剂之间的成功匹配通常可以通过检测几种市售试剂来实现。转染试剂体积也是关键——过少将不能高效转染；过多可能具有细胞毒性。在设计转染试剂筛选实验时，应同时考虑 siRNA 转染效率和细胞活力。理想的试剂是能有效减少靶基因而无显著细胞死亡的试剂。在 HepG2 细胞中，siPORT™ NeoFX™ 转染试剂显示仅有极小的毒性并产生广泛的沉默活性（图 4）。有些试剂和细胞系的灵活性不高，需要更高的精度。Ambion 建议测试已针对 siRNA 转染专门进行验证的转染试剂。我们发现，大多数基于 DNA 的转染试剂对 siRNA 递送无效。

图 4.转染试剂细胞毒性。HepG2 细胞的反向转染中使用了 多种 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂体积 (0.03-1.0 µL, Ambion)。在 96 孔板中使用 5 nM GAPDH siRNA (Silencer GAPDH siRNA, Ambion) 或阴性对照 siRNA（Silencer 阴性对照 #1 siRNA，Ambion）进行了检测。按照图 3A 所述测定了剩余基因表达（柱）。还使用 ViaCount 检测试剂盒 (Guava Technologies) 测量了细胞活力（线）。随着试剂体积增加，获得了更高水平的 siRNA 介导的靶基因表达降低。在这种细胞类型中，siPORT NeoFX 显示仅有极小的毒性并产生广泛的沉默活性。有些试剂的灵活性不高，需要更高的精度。

应优化细胞暴露于转染试剂的时间，以通过改变转染试剂的用量和细胞暴露于转染复合物的时间，尽可能降低细胞毒性并尽可能提高 siRNA 活性（图 5）。在指定时间点从孔中去除含转染试剂的培养基，并更换为新鲜培养基。在添加 1 或 2 µL 转染试剂 + GAPDH siRNA 或阴性对照 siRNA 后 48 小时测量细胞活力、细胞凋亡和 siRNA 活性。在未去除转染试剂的孔中，细胞出现坏死，它们发生中等水平的细胞凋亡，细胞活力比未处理的对照孔低 > 30%。然而，这些相同的样本显示与阴性对照孔相比，GAPDH 基因表达降低了 > 90%。在转染后 4 小时去除转染复合物时，细胞活力为 > 95%，细胞凋亡极轻微，但 GAPDH 沉默率比未进行培养基更换的培养物低 30%。当细胞在培养基更换前在转染后暴露于 1 µL 转染试剂 24 小时时，GAPDH 沉默率较高，与未进行培养基更换的细胞相当，细胞活力接近 90%。这些数据表明，仔细优化细胞对转染复合物的暴露可改善 RNAi 实验中生成的数据的质量。

图 5.转染复合物的暴露时间。将 HeLa 细胞（5 x 103 个细胞/孔）暴露于含两种浓度之一的转染试剂 (1-2 µL) + 10 nM GAPDH (Silencer GAPDH siRNA, Ambion) 或阴性对照 siRNA（Silencer 阴性对照 #1 siRNA，Ambion）的转染复合物。在不同时间点更换培养基以去除转染复合物。在转染开始后 48 小时测定细胞活力、细胞凋亡和 siRNA 活性。使用 ViaCount 检测试剂盒 (Guava Technologies) 测量了细胞活力（蓝色线）。使用 Guava PCA™-96 仪器 (Guava Technologies) 测量了细胞凋亡（黄色线）。按照图 3A 所述测定了剩余基因表达（绿色柱）。NT = 未转染

 siRNA 的质量和数量。
用于转染的 siRNA 的质量和数量会显著影响 RNAi 实验。siRNA 应不含合成过程中残留的污染物，包括盐、蛋白和乙醇。此外，siRNA 还应 < 30 bp，因为存在大于约 30 bp 的 dsRNA 已被证明可通过激活非特异性干扰素应答改变基因表达 [3]。

siRNA 的最佳浓度受靶基因特性和细胞类型等几个因素的影响。如上所述，过多的 siRNA 可能导致脱靶效应；过少可能导致无法检测到基因沉默。通常，1-30 nM siRNA 是优化转染的良好浓度范围（10 nM 是足够的起点）。在图 6 中，在极低浓度的 siRNA 下对 HeLa 细胞的转染进行了优化。HeLa 细胞比许多其他细胞类型更容易转染，与反向转染结合时，10 nM siRNA 足以实现理想的靶基因减少。

图 6.siRNA 的理想用量。将 HeLa 细胞稀释分瓶并以 4.0 x 104 个细胞/mL 重悬于生长培养基中。制备含指定浓度的化学合成 GAPDH siRNA (Ambion) 或阴性对照 siRNA #1（Ambion；未显示数据）以及 0.3 µL siPORT™ NeoFX™ 转染试剂 (Ambion) 的转染复合物。转染后 48 小时，收获细胞并通过实时 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 和 18S rRNA 水平。按照图 3A 所述测定了剩余基因表达。

没有单独的转染参数本身可确保培养物中的细胞高效摄取 siRNA。通过系统地处理几个关键变量中的每一个，实现活细胞的理想 siRNA 摄取。Ambion 提供了一系列用于简化 RNAi 实验的工具，包括专门设计两种siRNA转染试剂用于siRNA递送。siPORT NeoFX 和 siPORT 胺转染试剂均可用于将 siRNA 反向转染或标准转染至多种类型的细胞中。siPORT 转染 II 试剂盒含有这两种试剂的样本以及用于方案优化的阳性和阴性对照 siRNA。Ambion 的 siRNA 递送资源提供了有关转染优化、转染试剂建议和特定细胞类型配合使用条件的更多详细信息。

siPORT™ 胺由 Mirus 为 Ambion 生产。

科学参与人员
Rich Jarvis • Ambion, Inc.