使用 siRNA 文库评估基因功能

专注于特定基因类别的 siRNA 集（也称为 siRNA 文库）能够大幅提高通路分析和功能基因组学研究的速度。以下是 Ambion 的 Silencer™ 激酶 siRNA 文库的强大功能示例，由 Cenix BioScience GmbH 进行的初步筛选实验证明了这一点。此高度验证文库包括近 1800 种个体 siRNA（靶向 597 种人激酶）。在本实验中，对来自文库的 178 种 siRNA（靶向 HeLa 细胞中表达的 178 种不同的激酶）分别进行了检测，以确定它们对细胞增殖和有丝分裂指数的影响。该筛选确定了多种参与细胞周期的激酶基因，证实了已知参与细胞周期的一些激酶，并确定了先前未报告参与细胞周期的一些激酶。

Silencer 激酶 siRNA 文库包括超过 600 种经验证的 siRNA，已证明当以 100 nM 的浓度将这些 siRNA 转染至 HeLa 细胞中时，其可使靶标 mRNA 水平降低 > 70%。Cenix BioScience 选择这些经验证的 siRNA 中的 178 种（靶向 178 种不同的激酶）进行他们的实验。将这些 siRNA 以 100 nM 的最终浓度单独转染至 HeLa 细胞中（一式三份），在转染前 24 小时在 96 孔板中以约 8000 个细胞/孔的密度对细胞进行铺板。将经验证的靶向细胞周期蛋白 B1 的 siRNA 用作阳性对照。细胞周期蛋白 B1 是一种经过充分研究的已知在启动有丝分裂的过程中发挥关键作用的细胞周期调节因子，因此预计在本研究中会导致有丝分裂指数明显降低。将 Silencer 阴性对照 #1 siRNA (Ambion) 用作"加扰"序列阴性对照。

转染后 48 小时，固定细胞并用 DAPI 染色以显示染色质，用抗微管蛋白进行微管分布分析，并用抗磷酸化组蛋白 H3 抗体鉴定有丝分裂细胞。对各孔中的细胞数进行计数，借此监测细胞增殖程度。通过荧光显微镜检查评估处于有丝分裂期的细胞的百分比或“有丝分裂指数”。此外，从平行样本中分离 RNA 并进行逆转录以生成 cDNA，然后通过实时荧光定量 PCR 测量靶标水平。

在任何 siRNA 实验中，数据分析的一个重要组成部分是监测由特定 siRNA 引起的 mRNA 降解或“敲低”的程度。实时荧光定量 PCR 是一种快速而灵敏的技术，非常适合此目的。图 1 显示了通过实时荧光定量 PCR 监测的 siRNA 转染后 48 小时时剩余的靶标 mRNA。对于每种激酶 siRNA，与用阴性对照 siRNA 转染后获得的 mRNA 水平相比，靶标 mRNA 水平降低 70% 或更高。

图 1. 来自 Silencer™ 激酶 siRNA 文库的 178 种激酶 siRNA 引起的 mRNA 沉默。在 96 孔板中以约 8000 个细胞/孔的密度对 HeLa 细胞进行铺板。在 24 小时后，用每种 siRNA (100 nM) 转染细胞，一式三份。在转染后 48 小时，分离 RNA，将其转化为 cDNA，并通过实时荧光定量 PCR 进行分析。图中显示的是与用对照加扰 siRNA（红色条，Silencer 阴性对照 #1 siRNA）转染的细胞相比时的相对 mRNA 水平。

图 2 展示了每种 siRNA 对细胞增殖的影响。在转染阴性对照 siRNA 的孔中，48 小时后约有 1,250 个细胞/显微图像（图 2）。细胞周期蛋白 B1（已知其对有丝分裂的启动至关重要）抑制导致生长停滞。与预期一致，靶向细胞周期蛋白 B1 的 siRNA 显著抑制细胞增殖；在用该 siRNA 转染的孔中有 < 700 个细胞/显微图像。图 2 还显示了抑制细胞增殖的多种激酶 siRNA。这种抑制可能由多种根本原因导致，将这些原因分为以下三大类：引起细胞坏死的效应、引起细胞凋亡的效应和引起细胞周期失调的效应。有趣的是，一些激酶 siRNA 对细胞增殖有刺激作用。

图 2.来自 Silencer™ 激酶 siRNA 文库的 178 种激酶 siRNA 诱导的细胞增殖变化。用靶向 178 种不同激酶的个体 siRNA 转染 HeLa 细胞，如图 1 所述。在转染后 48 小时对细胞进行计数。显示每个显微图像中的细胞数。

更好地了解基因在细胞周期进程中的作用的一种方法是，在进行和不进行 siRNA 处理的情况下，在任何给定时间点监测处于有丝分裂期的细胞的百分比。对于异步生长的培养物（如这些实验中使用的培养物），有丝分裂指数反映了细胞处于有丝分裂期与处于细胞周期其他时期的时间的分数。因此，如图 3 所示，观察到用加扰 siRNA 转染的对照细胞的有丝分裂指数值约为 2.5%，这表明细胞处于有丝分裂期的时间占细胞周期的 2.5%。

图 3.用来自 Silencer™ 激酶 siRNA 文库的 178 种 siRNA 转染的细胞的有丝分裂指数。用靶向 178 种不同激酶的个体 siRNA 转染 HeLa 细胞，如图 1 所述。测定转染后 48 小时的有丝分裂指数。橙色条显示了处于有丝分裂期的阴性对照细胞（用对照加扰 siRNA 转染这些细胞）的百分比（有丝分裂指数范围为 2.1 至 2.3）。半透明棕色矩形突出显示了正常有丝分裂指数的第 95 百分位数范围。插图显示了靶向两种不同激酶的 siRNA 诱导的两种有趣的有丝分裂停滞表型（绿色 = 染色质；橙色 = 微管蛋白）。

在 siRNA 转染后 48 小时监测到多种 siRNA 诱导有丝分裂指数出现显著变化。有丝分裂指数降低反映了有丝分裂期缩短或间期延长或“停滞”。相反，有丝分裂指数增加是有丝分裂期延长（通常为停滞）或间期缩短所致。在检测的 siRNA 中观察到这两种结果。其中两种 siRNA 使有丝分裂指数增加了 5 倍以上。

然后通过显微镜读数检查有丝分裂停滞表型，以确定其根本原因。方法是对多种标记物进行免疫荧光染色，包括对微管蛋白进行免疫荧光染色以显示微管分布。此方法揭示了一种触发前中期样停滞状态（有丝分裂指数接近 16%，或约为正常值的 7 倍）的激酶 siRNA，其中纺锤体明显为双极性，染色体凝集良好，但没有染色体成功对齐的证据（上图，左插图）。这可能对应于经过充分研究的纺锤体组装检查点的激活，该检查点可监测纺锤体微管与着丝粒之间的正确功能性相互作用，为进入中期以及随后进入后期做准备。同样可形成有丝分裂停滞期细胞的另一种激酶 siRNA 诱导形成异常纺锤体，显示明显的纺锤体极数量太多或太少（例如，上图，右插图）。

本筛选实验阐述了较高内涵、多参数检测与高效 siRNA 文库相结合的强大功能。通过此特定数据集研究人员能够超越原始读数（在此情况下对细胞增殖的影响），利用单次筛选实验高效而直接地解决根本原因，如多个水平的细胞周期失调。通过比较细胞增殖和有丝分裂指数数据，可以将观察到的靶向 siRNA 的多种激酶的抗细胞增殖作用与对细胞周期调节的潜在影响联系起来。

通过细胞周期的 G1、S 和 G2 期进行细胞传代所需的沉默激酶预计可延长间期，从而降低处于有丝分裂期的细胞的百分比。它还会降低总体细胞增殖速率。此处研究的多种 siRNA 诱导了该表型（图 4）。同样，通过有丝分裂进行传代所需的激酶抑制预计会导致有丝分裂指数增加和细胞增殖减少。多种 siRNA 也可诱导该表型。

图 4.靶向 178 种激酶的 siRNA 诱导的细胞数量和有丝分裂指数的偏差。图 2 与图 3 的数据图表明某些激酶的沉默会严重影响细胞周期。可以定义多个数据类别，如 1) 无变化，2) 细胞生长增加，有丝分裂指数无变化，3) 细胞生长无变化，有丝分裂指数增加等。以红色显示的是在细胞周期的 G1、S 或 G2 期（左侧）显示停滞的细胞以及在 M 期（右侧）显示停滞的细胞。

对于细胞增殖变化与异常有丝分裂指数无关的情况，需要将坏死和细胞凋亡作为可能原因进行后续分析。出于这种考虑，Cenix 最近开发了一种多重检测，可在一次筛选实验中监测细胞增殖、有丝分裂指数、坏死和细胞凋亡等全部特征。利用这种检测和其他基础的和/或以疾病为中心的 RNAi 检测，Cenix 正在进一步研究激酶和 Ambion 的 Silencer siRNA 文库涵盖的其他基因的作用。