大规模 siRNA 筛选可用于识别直接或间接参与感兴趣机制或通路的基因。通常，这些筛选中的读数采用基于细胞的检测或报告基因检测。siRNA 筛选后的一个常见步骤是使用独立方法（如实时 RT-PCR）验证筛选结果，以检测 siRNA 诱导的 mRNA 靶标敲低。根据检测的 siRNA 数量，此验证可能需要比筛选本身更长的时间。Applied Biosystems 的两位科学家将这一步骤简化了 10 倍以上，在一周内对使用靶向 500 多种基因的 1500 多个 siRNA 处理的细胞进行了实时 RT-PCR。本文讨论了该简化的工作流程。

简化的工作流程可将实验时间缩短至一周

对于大规模 siRNA 筛选，验证过程可能非常耗时。本文描述了使用实时 RT-PCR 测量 siRNA 诱导的 mRNA 靶标敲低的简化工作流程。这种简化的工作流程消除了费力的 RNA 分离步骤并减少了处理样本所需的平板和吸头数量，可在一周内通过 1500 多个 siRNA 进行靶标敲低分析，且手动操作时间极短。

该工作流程使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT™ 试剂盒和 TaqMan 基因表达检测试剂盒来测量各 siRNA 对靶基因表达的影响。Cells-to-CT 方法的速度和 TaqMan 实时荧光定量 PCR 方法的耐用性可尽可能提高工作流程通量，同时确保获得可靠的结果（图 1）。Applied Biosystems 的两位科学家使用 Ambion Silencer Select siRNA 证明了这一工作流程，并行检测显示 Ambion Silencer Select siRNA 可产生比类似技术更好的敲低效果和更一致的数据 [1]。Silencer Select siRNA 还包含新型化学修饰，可使脱靶效应降低达 90%。

图 1.高通量 siRNA 筛选工作流程。该工作流程基于 36 个 96 孔板进行。如果可使用一个以上的 Applied Biosystems 7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统，则可进一步缩短实时荧光定量 PCR 所需的时间。

siRNA 转染

使用 Tecan Freedom EVO 200 液体处理系统稀释 Silencer Select siRNA 并分配至 96 孔转染板中。布置 siRNA 平板图，使每份生物学重复样本位于平板的不同区域，以减少任何位置效应对数据的影响。然后使用 Lipofectamine™ 2000 试剂 (Invitrogen) 将 siRNA 反向转染至 HeLa 细胞中（4,000 个细胞/孔）。

siRNA 实验中的阳性和阴性对照至关重要，尤其是在处理大量样本时。甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 基因被广泛认为是阳性对照 siRNA 的良好靶标，因为其在几乎所有哺乳动物细胞中具有普遍的高表达。用于验证转染效率的阳性对照包括 Silencer Select GAPDH siRNA 和 3 种内部定制设计的靶向 ALDH1B1 的 siRNA。阴性对照包括未转染细胞和纯化 RNA，已对其进行了 GAPDH 表达检测。

样本制备

使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒制备样本，用于在转染后 48 小时进行实时荧光定量 PCR。选择此方法是因为其速度快且易于进行自动化。TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒不需要在逆转录前分离 RNA（一个可耗时达 60 分钟的多步骤程序），而是利用一种新型缓冲液，在室温下于 7 分钟内即可裂解细胞。然后，裂解物可直接用作逆转录 (RT) 反应的底物。使用 CyBio CyBi-Well vario 移液工作站将 Cells-to-CT 试剂移至平板中。

实时 RT-PCR

样本制备后，在 Applied Biosystems GeneAmp PCR 系统 9700 上使用 20% 裂解物起始量进行逆转录。为了提高通量并缩短验证实验的总体持续时间，准备额外的平板使用 Cells-to-CT 程序进行 cDNA 合成，同时其他平板进行 60 分钟 RT 孵育。RT 反应完成后，将 cDNA 转移至预装适当 TaqMan 基因表达检测试剂盒的定制 384 孔板中（参见边栏“siRNA 诱导敲低的简化验证解决方案”）。使用预铺板检测是另一种省时的方法。最后，向各孔中添加基因表达预混液和不含核酸酶的水，并使用自动扭转臂在 7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统上运行平板。为了进行数据分析，研究人员使用 ΔΔCT 方法来计算相对敲低。相对于用 Silencer Select 阴性对照 #2 siRNA（使用 18S rRNA 作为归一化基因）处理的样本表示敲低。数据分析方法与先前讨论的方法相似 [2]。

在不影响数据质量的情况下加快工作流程

AB 科学家通过将 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒、TaqMan 基因表达检测试剂盒和简单的自动化程序并入单一工作流程中，可将 siRNA 诱导敲低检测的每周通量提高 10 倍以上。图 2 显示了一周工作的一小部分结果。与预期一致，使用 Silencer Select siRNA 进行转染产生的靶标 mRNA 敲低水平较高（图 2），转染之间具有出色的重现性（图 3）。事实上，先前的实验 [3] 已经证明，从基于 RNA 分离的方法转为 Cells-to-CT 方法（其中直接使用细胞裂解物进行逆转录）不会影响重现性。


图 2.使用简化工作流程检测的 Silencer Select siRNA 显示出色的敲低效率。对于每个基因靶标（x 轴，上部标签），转染了 3 个 siRNA（x 轴，下部标签），每个 siRNA 设置 4 份重复样本。使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT™ 试剂盒裂解细胞，并使用指定 TaqMan 基因表达检测试剂盒直接在细胞裂解物中进行实时 RT-PCR。相对于用 Silencer Select 阴性对照 #2 siRNA 转染的细胞的数据表示敲低数据。阳性对照是靶向 ALDH1B1 的内部定制 siRNA。



图 3.简化的 siRNA 检测工作流程具有较高的重复样本重现性。对于每个 siRNA，进行 4 次重复转染。使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT™ 试剂盒裂解细胞，并直接在细胞裂解物中进行实时 RT-PCR。相对于用 Silencer Select 阴性对照 #2 siRNA 转染的细胞的数据计算敲低数据。从 4 份重复样本的中位值中减去各重复样本的值，计算变异性。在所有转染的 siRNA 中，每份重复样本的靶标敲低变异性以箱形图表示（参见边栏“如何解读箱形图”）。

结论

本研究证明，通过将 Silencer Select siRNA、TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒和预铺板 TaqMan 基因表达检测试剂盒并入单一工作流程中，可使大规模 siRNA 筛选和后续 RT-PCR 敲低验证变得更加快速和简单。更快的程序不会损害数据质量，出色的敲低和较高的重现性证明了这一点。

科学参与人员
Rajeev Varma, Josquin Holmes, Angie Cheng, Susan Magdaleno • Applied Biosystems