虽然这种方法非常有效，但无法对基因如何在整个生物体内发挥作用进行关键性评估。为解决这个问题，研究人员目前正在体内应用 RNAi。尽管研究仍处于早期，但在体内使用 RNAi 已显示出前景并取得了重大进展。

两种基本方法

调整两种触发 RNAi 的基本方法以在体内使用：递送 siRNA，以及递送表达短发夹 RNA（shRNA；随后加工成活性 siRNA）的质粒和病毒载体。与在培养细胞中应用 RNAi 一样，使用 siRNA 比使用 shRNA 表达载体更常见。对于在培养细胞中进行的 动物RNAi实验，更容易获得靶向特定感兴趣靶标的有效 siRNA，并且由于这些 siRNA 较小且仅需要穿过细胞膜而不需要穿过核膜发挥作用，所以更容易递送。相比之下，构建 shRNA 表达载体比较耗时，特别是当考虑到创建和测试多个 shRNA 序列以找到有效序列所需的时间时。siRNA 也比基于质粒的 shRNA 表达载体更容易递送，并且也不会像逆转录病毒（包括慢病毒）和腺病毒载体分别会出现插入诱变和免疫原性方面的相关问题。

动物RNAi实验

图 1.体内递送 siRNA 分子的策略。



siRNA 在体内成功介导基因沉默取决于 siRNA 在感兴趣特定组织的脉管系统中的有效递送和保留，以及在这些细胞中的有效摄取。此外，siRNA 必须保持稳定，直到能够到达其最终位置。虽然时间较早，但曾有关于局部和全身递送 siRNA 的成功报告。

成功局部给予 siRNA

获得的最大成功也许是在眼部进行 siRNA 局部给药。经证实在小鼠视网膜下腔注射靶向 VEGF 的 siRNA 可减少眼部血管新生 [1]。在该模型中，无需像在某些其他系统中需要对 siRNA 进行修饰或将 siRNA 与脂质聚合物或其他递送试剂复合。最近，由 Acuity Pharmaceuticals 开发并设计通过玻璃体内注射递送的靶向 VEGF 的 siRNA 进入了 II 期临床试验，用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。

在大鼠模型中，已使用外科植入泵通过鞘内输注成功将疼痛相关阳离子通道 P2X3 的经修饰 siRNA递送至大鼠脑中；在该模型系统中，siRNA 显著抑制了神经病理性疼痛反应 [2]。虽然这种方法对于许多研究人员来说并不实用，但其证明可以成功将 siRNA 局部递送至啮齿类动物的脑中，并且使用 siRNA 进行 CNS 相关基因的体内功能基因组学研究是可能的。

在研究肺部疾病和传染性疾病，以及可能治疗流感、SARS 和由 RNA 病毒引起的其他临床相关肺病的尝试中，研究人员对将 siRNA递送至肺部有相当大的兴趣。在一项有前景的研究中，在灵长类动物中使用鼻内递送系统递送 SARS 病毒特异性 siRNA，使得发热减少、病毒载量降低和肺泡损伤降低 [3]。该研究证实了 siRNA 经鼻内递送至肺部的有效性。

全身 siRNA递送进展

首次在小鼠中使用流体动力学尾静脉注射†证明了在哺乳动物中进行全身体内 siRNA递送的可行性。在该程序中，将未修饰的 siRNA 溶于大量水溶液中并快速注射至尾静脉，最终定位至肝细胞内 [3]。尽管该程序不具有临床相关性，但能够在啮齿动物肝脏内进行基因功能和药物靶标验证研究，直至开发出更有效的递送技术。为支持该技术，Song 及其同事发现流体动力学注射 Fas siRNA 导致小鼠肝细胞中的 Fas 沉默持续 10 天。这种处理可保护肝细胞免受 Fas 抗体和伴刀豆球蛋白 A 刺激导致的细胞凋亡，并保护小鼠不发生暴发性肝炎 [4]。同样，流体动力学尾静脉注射半胱天冬酶 8 siRNA 可保护小鼠不发生 Fas 抗体或 Fas 配基表达诱导的急性肝功能衰竭 [5]。

最近，在小鼠中以小体积、正常压力通过静脉递送靶向载脂蛋白 B 的经修饰 siRNA 导致肝脏和空肠发生了基因沉默。siRNA 可与胆固醇结合以进行靶向递送，并包括骨架和糖修饰以增强血清稳定性 [6]。

可能需要全身递送 siRNA 以靶向大多数肿瘤类型以及许多其他体内靶标。为此，几个小组正在研究使用基于脂质和基于纳米颗粒的 siRNA递送复合物 [7-10]。

全身递送 siRNA 的研究阐明了在体内成功递送 siRNA 必须克服的三个障碍：选择性递送至预期组织中、在前往靶组织的途中提供充分保护以防降解以及避免 siRNA 被快速排泄。令人惊讶的是，经证实快速排泄是比体内稳定性更重要的问题 [11]。尽管通过 siRNA 修饰可以很容易实现化学稳定性，但在大多数情况下显然是没有必要的，因为 siRNA 在降解之前就已经被排泄。目前使用纳米颗粒或脂质复合物在解决体内 siRNA递送特有的药代动力学和组织分布问题方面比化学修饰更有前景。

展望未来

RNAi 目前已成为大多数药物发明管线中的一种重要工具，该技术的进一步进展无疑将增强其在体内识别和验证潜在药物靶标方面的实用性。此外，siRNA 本身作为治疗药物具有巨大的潜力。如果实现这一目标，将对药品行业有革命性的影响。siRNA 治疗用途的最重要障碍是如何进行靶向递送。尽管已经取得了显著进展，但是将核酸递送至特定器官、组织和细胞还需要进一步进展，包括开发可能的新偶联物和/或制剂，以特异性靶向特定细胞。

† 体内核酸流体动力学递送涵盖在 Mirus Bio Corporation 的专利和专利申请中，包括美国专利 6,627,616, 6,379,966 和 6,897,068 以及全球相关申请。营利性实体的研究和商业用途需要许可证--有关联系信息，请访问 www.mirusbio.com。

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