本文分析了用于大规模筛选实验的两种策略（单个 siRNA 转染和 siRNA 库转染）的有效性。针对同一靶标检测至少两个算法衍生的不同 siRNA 的有效性提高，使得筛选假阳性靶标需要使用的资源减少，更重要的是，可尽可能降低遗漏有效靶标的风险。

在初始 RNA 干扰研究中，许多研究人员选择将靶向同一基因的不同区域的多个小干扰 RNA (siRNA) 结合起来，以促进靶标 mRNA 的降解。研究人员混合 siRNA 的想法源自以下发现：少于 50% 的随机设计 siRNA 可显著减少靶基因表达。这些实验表明，结合使用 siRNA 似乎不会发挥协同作用以影响靶基因表达，有时活性较低的 siRNA 会干扰更高效 siRNA 的活性。然而，合并策略提高了减少随机设计 siRNA 靶基因表达的可能性。

由于认识到强效 siRNA 具有共同的序列特性，人们推出了可显著提高有效 siRNA 序列的百分比的 siRNA 设计算法。例如，Cenix siRNA 设计算法（Ambion 的 Silencer 预设计 siRNA 基于此算法）的成功率 > 80%，其中大多数 siRNA 使靶基因表达减少 > 85%（图 1）。鉴于单个算法设计的 siRNA 的成功率，siRNA 合并的益处降低（图 2）。此外，最近对 siRNA 脱靶效应的观察 [1] 表明，结合使用多种 siRNA 实际上可能会增加靶基因以外的基因受到影响的可能性。


图 1.Silencer 预设计 siRNA 的效果。针对靶向近 400 个内源性表达的人类基因的 1100 多种 siRNA，检测了靶标 mRNA 减少情况。超过 82% 的 siRNA 使靶基因表达减少至少 70%，超过 61% 的 siRNA 使靶基因表达减少至少 85%。所有 siRNA 设计都以 Cenix BioScience 公司开发的算法为基础。



图 2.通过单独 siRNA 和 siRNA 库实现的靶标 mRNA 减少。在转染后 48 小时，通过实时 RT-PCR 监测用三种单独的 Silencer 预设计 siRNA (30 nM) 或合并所有三种 siRNA（各 10 nM）的库转染的细胞的靶标 mRNA 减少情况。相对靶标 mRNA 表达表示为采用 Silencer 阴性对照 #1 siRNA (Ambion) 转染的细胞中表达的 mRNA 的百分比。利用 18S rRNA 实时 RT-PCR 对所有实时 RT-PCR 数据进行归一化。

比较 siRNA 库和单独 siRNA：实验设计和结果

使用定量表型检测确定单独 siRNA 相对于 siRNA 库的执行效果。研究了靶向 59 个激酶的 siRNA 以及阳性和阴性对照 siRNA。使用三种单独的 siRNA（siRNA #1、siRNA #2 或 siRNA #3，全部靶向同一基因）或三种 siRNA 合并的库 (siRNA #1 + siRNA #2 + siRNA #3) 转染细胞群。在下述实验中，转染后三天对细胞数量进行监测（图 3），或转染后一天使用依托泊苷来诱导细胞凋亡，并在转染后三天测定半胱天冬酶 3 活性（图 4）。所有转染细胞都使用染料和底物的预混液在同一天检测，以尽可能降低研究中的实验变异性。


图 3.细胞增殖 - 单独 siRNA vs. siRNA 库。(A) 使用三种单独激酶特异性 siRNA 或三种 siRNA 合并的库在 96 孔板中转染，使得 HeLa 细胞中 59 种激酶的表达水平降低。对所有样本进行三次平行实验。在称为反向转染的过程中，向含 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂和三种 siRNA 之一 (30 nM) 或三种 siRNA 合并的库（各 10 nM）的每个孔中，加入 8 x 103 个 HeLa 细胞 [2]。转染后 3 天，使用 alamarBlue (AccuMed International) 测定细胞。显示了平均值 ± 标准差。图中的柱代表每种 siRNA 或 siRNA 库相对于阴性对照（Silencer 阴性对照 #1 siRNA；Ambion）转染样本的平均 alamarBlue 结果。 (B) 显示了特定基因的代表性结果，以举例说明使用多种 siRNA 组合获得的表达结果之间出现的一致和不一致的类型。y 轴上的零设置为比阴性对照转染样本的平均信号低 2 个标准差的值。低于零的柱表示与阴性对照存在显著差异，因此代表检测中的命中结果。



图 4.半胱天冬酶 3 活化 - 单独 siRNA vs. siRNA 库。(A) 使用三种单独激酶特异性 siRNA 或 siRNA 库在 96 孔板中转染，使得 HeLa 细胞中 59 种激酶的表达水平降低。对所有样本进行三次平行实验。转染后 1 天，用依托泊苷处理细胞以激活细胞凋亡通路。转染后 3 天，对细胞进行计数并裂解。测定裂解物中的半胱天冬酶 3 活性，并根据细胞数量进行归一化。显示了三份重复样本的平均值 ± 标准差，其中 y 轴上的零设置为比阴性对照转染样本的平均信号低 2 个标准差的值。因此，低于零的柱表示与阴性对照存在显著差异，代表检测中的命中结果。图中的柱代表相对于阴性对照（Silencer 阴性对照 #1 siRNA；Ambion）转染样本的平均半胱天冬酶 3 活性。 (B) 特定基因的代表性结果阐明了多种 siRNA 之间出现的一致和不一致的类型。


细胞增殖结果
采用基于 alamarBlue (AccuMed International) 微孔板的检测法测量细胞数量。通过高通量显微镜检查确认了这些结果。如图 3A 所示，与阴性对照转染样本相比，靶向多种激酶的 siRNA 对细胞数量有不同影响。靶向同一基因的不同 siRNA 通常对细胞增殖具有相似影响；然而，三种单独的 siRNA 中的一种通常表现出与其他两种 siRNA 不同的行为。同样，siRNA 库通常不会显示与大多数单独转染的 siRNA 一致的表型（图 3B）。

细胞凋亡试验结果
在筛选影响细胞凋亡的激酶时，在 siRNA 转染和依托泊苷处理后测量细胞数量和半胱天冬酶 3 活性。有必要测定细胞数量，因为一些转染的 siRNA 以不同方式改变了细胞生长或存活情况。通过根据细胞数量对半胱天冬酶 3 活性数据进行归一化，我们可将数据表示为半胱天冬酶 3 活性/细胞。与预期一致，几种激酶的表达减少抑制了依托泊苷对半胱天冬酶 3 的活化作用，表明这些激酶在细胞凋亡中发挥作用（图 4）。每个基因的单独 siRNA 均对半胱天冬酶 3 活性具有相似但不相同的影响，这与细胞增殖结果一致。siRNA 库的结果仅与单独 siRNA 的结果部分重叠（图 5），这与细胞增殖结果也一致。单独和合并 siRNA 结果的示例见图 4B。


图 5.单独 siRNA 和 siRNA 库的总体性能。将命中定义为两种单独 siRNA 产生的表型与阴性对照 siRNA 转染样本的表型存在显著差异的基因，使用该定义比较了每种单独 siRNA（siRNA #1、#2 或 #3）以及三种 siRNA 的 siRNA 库的性能。使用两种（#1 + #2、#1 + #3 和 #2 + #3）或三种 (#1 + #2 + #3) 单独 siRNA 进行筛选的合并结果显示，该策略准确度较高。准确的命中预测结果和不准确的命中预测结果分别显示为绿色和橙色。假阴性结果显示为灰色。

单独 siRNA vs. siRNA 库：结果

为尽可能减少实验变异性，同时使用相同的细胞系和底物生成用于比较单独和合并 siRNA 对增殖和半胱天冬酶 3 活化的影响的数据。使用筛选结果确定转染一系列三种单独 siRNA 相对于转染三种 siRNA 合并的库的有效性，以确定基因"命中"情况。在我们的筛选中，命中定义为筛选实验中两种单独 siRNA 产生的表型与阴性对照（Silencer 阴性对照 #1 siRNA，Ambion）转染样本的表型存在统计学差异的基因。

  • 假阳性。对于增殖和半胱天冬酶 3 检测，通过合并 siRNA 结果预测的命中可通过单独 siRNA 进行验证的不到 60%（假阳性，图 5）。
  • 假阴性。虽然假阳性结果分析会浪费时间和资源，但更值得关注的是，当基因靶标确实参与正在分析的通路时，未能标记为命中的基因。这些情况称为假
  • 阴性，尤其普遍见于 siRNA 库：合并 siRNA 的结果表明该基因不参与细胞凋亡通路，而靶向相同靶标的两种或更多单独 siRNA 的结果表明该基因对细胞凋亡通路的活化具有重要作用。在这两项筛选实验中，合并 siRNA 实验的假阴性率为 50%，表明使用 siRNA 库进行筛选可导致失去鉴别靶基因的机会。
  • 使用一种以上的单独 siRNA。尽管与使用 siRNA 库的实验相比使用单独 siRNA 时问题较少，但仅涉及单独的基因特异性 siRNA 的研究容易出现上述相对较高的假阳性率和假阴性率。针对每个基因使用两种（最好是三种）不同的 siRNA 显著降低了筛选的假阴性率，从而能够在分析的集合中识别出更完整的感兴趣基因补体（图 5）。

表型 vs. siRNA 效果

单独 siRNA 与合并 siRNA 之间差异的一个可能解释是每种情况下的转染后靶基因表达水平各不相同。为解决这一问题，我们测量了使用靶向 9 个不同基因的单独和合并 siRNA 转染的细胞中的细胞数量和 mRNA 敲低。如图 6 所示，每个不同基因的细胞表型与 mRNA 敲低之间的平均相关性都较低，表明不同 siRNA 诱导的表型变异性不太可能是由 siRNA 效果引起的。


图 6.转染细胞的表型 vs. mRNA 敲低。用靶向 X 轴上显示的 9 个基因中的每一个的三种不同的单独 siRNA 和 siRNA 库转染 HeLa 细胞。转染后 3 天，使用 alamarBlue (AccuMed International) 测定孔的细胞数量 (A)。分离细胞中的 RNA 并通过实时 RT-PCR 测定靶标 mRNA 表达 (B)。alamarBlue 和靶标 mRNA 定量测定结果表示为使用 Silencer 阴性对照 #1 siRNA (Ambion) 转染的细胞的百分比。

结论

使用 9 种不同的表型检测（包括蛋白活化、细胞形态和细胞骨架形成）对单独 siRNA 与合并 siRNA 进行了类似比较。我们的结果表明，使用合并 siRNA 的实验得到的假阳性率始终 > 50%，假阴性率始终 > 40%。针对每个靶标检测单独 siRNA 的假阳性率和假阴性率略低，但检测过程同样费力。靶向相同基因的单独 siRNA 与合并 siRNA 之间的表型差异可能反映了 siRNA 脱靶效应的变异性。为了克服这一问题，我们发现非常重要的第一点是，在单独转染过程中针对每个靶基因使用多个单独 siRNA 来确认某表型对于基因表达减少具有特异性，而不是由于单独 siRNA 或 siRNA 库的脱靶效应所致。

科学参与人员
David Brown, Mike Byrom, Joe Krebs, Kevin Kelnar, Rich Jarvis, Amanda Campbell, Lance Ford • Ambion, Inc.