RNA 干扰 (RNAi) 是一种天然机制，通过该机制小干扰 RNA (siRNA) 介导靶向 RNA 分子的序列特异性降解。利用这种现象的技术可用于功能基因组学和靶标验证，并且正在开发用于治疗。因为其拥有的效力，siRNA 已迅速成为培养哺乳动物细胞中诱导基因敲低广泛使用的触发因素。体内 siRNA 递送是一项更具挑战性的任务。本文描述了在采用流体动力学尾静脉注射给予 siRNA 的动物模型中进行的 RNAi 实验。

RNAi 给药途径

越来越多的体内 RNAi 研究使用小鼠模型。有许多关于 siRNA 和反义寡核苷酸成功局部给药的报告。例如，多个组织已专注于开发用于眼部相关疾病的基于寡核苷酸的治疗方法 [1]。由于直接将寡核苷酸注入眼睛，因此与全身药物递送所需的材料量相比，所需材料量更小（因此成本更低）。靶向眼组织的其他优点包括：与血液相比，眼部 RNase 水平更低，以及可促进眼部细胞摄取 siRNA 的固有宿主防御和清除机制。向呼吸系统局部递送 siRNA 也显示具有前景。几个研究团队已证明，鼻内给予合成 siRNA（含或不含转染试剂）可有效治疗流感和呼吸道合胞病毒 [2, 3]。

与全身递送有关的问题

由于局部给予 siRNA 无法进入大多数靶组织或器官，最终目标是通过静脉注射实现全身递送途径。除将 siRNA 递送到内脏器官的实际问题外，有时还需要在多种组织内抑制基因表达（例如，高度转移性肿瘤治疗期间）。血液中体积 <10 nm 的分子的快速血清除、血流中的 RNA 降解和 siRNA 的较差细胞渗透率（由于其大分子量和高负电荷）等因素限制了全身递送的成功。

siRNA 递送至肝脏的全身给药

虽然开发有效的技术以通过全身给药将 siRNA 递送至许多组织中还需要开展额外工作，但向小鼠肝脏递送相当简单。在本文中，我们描述了通过流体动力学（高压）尾静脉注射将 siRNA 递送至小鼠肝脏的过程 [4]。由于在几秒内通过静脉注射较大体积（等于血液体积），因此 siRNA 与血液接触时间有限，siRNA 几乎是定量并且特异性递送到肝脏细胞中。在这些实验中，共注射 siRNA 和报告基因载体，并在 mRNA 和蛋白水平上测定了组织样本中外源性基因表达的敲低 [参见边栏，“方法”和“pMIR-REPORT™ miRNA 表达报告基因载体系统的应用”]。

当仅注射 pMIR-REPORT 荧光素酶载体时，在肝脏样本中检测到高水平（蛋白和 RNA 水平）萤火虫荧光素酶 (fLuc) 表达。fLuc 基因在肝脏中的表达量是在肾脏、脾脏和肺中表达量的 100-1000 倍，表明报告基因载体靶向肝脏递送（未显示数据）。当共注射 pMIR-REPORT 荧光素酶载体、fLuc 特异性 Silencer siRNA 和 pMIR-REPORT β-半乳糖苷酶载体（用于归一化递送效率）时，观察到 fLuc 蛋白（图 1A）和相应 mRNA（图 1B）水平显著降低。在注射非特异性 Silencer 阴性对照 #1 siRNA 的对照组中未检测到 fLuc 减少。


图 1：siRNA 诱导小鼠肝脏中 fLuc 蛋白和 mRNA 水平降低。将 Ambion pMIR-REPORT™ 荧光素酶和 β 半乳糖苷酶载体和靶向萤火虫荧光素酶 (fLuc) 的 siRNA（1 或 5 nmol）以恒定高压注入 7 只小鼠的尾静脉。将数据归一化至注射 Silencer 阴性对照 #1 siRNA 的 4 只小鼠的平均结果。图 A：使用 Tropix Dual-Light 发光报告基因检测系统 (Applied Biosystems) 测定 fLuc 和 β 半乳糖苷酶 (β-gal) 蛋白水平。每个条代表一只动物，进行三次重复读数。图 B：TaqMan 基因表达检测试剂盒用于测定 fLuc mRNA 水平。每个条代表一只动物，进行三次重复读数并取平均值。


数据显示如下：
  1. pMIR-REPORT 荧光素酶 miRNA 表达报告基因载体（原样，或与克隆靶标一起）可在体内使用，并通过流体动力学注射递送至小鼠肝脏。
  2. siRNA 可以通过在肝脏细胞内共递送的报告基因载体，实现特异性和强效的基因表达敲低。
  3. Dual-Light 发光报告基因检测系统可检测组织样本粗品中的 fLuc 和 β–gal 蛋白。

改进体内 siRNA 递送

通过流体动力学尾静脉注射共递送 siRNA 和报告基因载体为有兴趣在肝脏中进行 RNAi 实验的研究人员提供了一个起点。需要开发替代技术，以便使用正常低压注射条件特异性递送至其他器官。

在 Mirus Bio Corporation 的许可下进行了流体动力学尾静脉注射。

科学参与人员
Alexander V Vlassov, Mu Li, Susan Magdaleno • Applied Biosystems, Austin, TX

参考文献
  1. Tolentino MJ, Brucker AJ, Fosnot J, Ying GS, Wu IH, Malik G, Wan S, Reich SJ (2004) Intravitreal injection of vascular endothelial growth factor small interfering RNA inhibits growth and leakage in a nonhuman primate, laser-induced model of choroidal neovascularization.Retina 24:132–138.
  2. Tompkins SM, Lo CY, Tumpey TM, Epstein SL (2004) Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo.Proc Natl Acad Sci USA 101(23):8682-8686.
  3. Bitko V, Musiyenko A, Shulyayeva O, Barik S (2005) Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA.Nat Med 11(1):50–55.
  4. Zhang G, Budker V, Wolff JA (1999) High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.Hum Gene Ther 10(10):1735–1737.