RNA 干扰 (RNAi) 是一种进化上保守的基因表达沉默机制

化学合成的短干扰 RNA (siRNA) 可用于在培养的哺乳动物细胞中诱导沉默。细胞摄取后，siRNA 的引导链被整合到 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC) 中，该复合体可引导含互补序列的信使 RNA 降解。siRNA 广泛用作了解健康和患病细胞及动物中细胞通路的基因功能的工具，在治疗性基因沉默方面拥有巨大潜力。在此，我们回答了有关将 siRNA 转染至人细胞中引起的 RNAi 效应的持续性的问题。

最近，Applied Biosystems 推出了下一代 siRNA 产品 Ambion Silencer Select siRNA。这些 siRNA 使用可提高沉默效率和效力的新算法设计而成，并且通过锁核酸 (LNA) 进行了化学修饰以提高特异性并减少脱靶效应。Applied Biosystems 科学家研究了这些 siRNA 在两个细胞系中诱导的沉默的持续时间，并研究了 siRNA 浓度和重复转染对沉默持续时间的影响。

在使用强效和高效 siRNA（例如新的 Ambion Silencer Select siRNA）处理的易转染细胞中，可在 5-7 天内实现近似最大沉默。图 1 显示了来自代表性实验的数据。四种不同 Silencer Select 预设计 siRNA 以 5 nM 浓度转染到 HeLa 细胞中。在转染后第 2 天观察到最大敲低 (>85%)，在第 5-7 天敲低持续保持在 >80%。除了一个 siRNA 外，在第 10 天仍观察到显著敲低。应注意的是，HeLa 细胞属于易转染类别，在 0.15 µL/孔（96 孔规格）的低转染试剂浓度下可实现良好敲低情况（不影响细胞活力）。在 BJ 细胞中观察到相似的 siRNA 诱导沉默持续时间（图 2），但实现高效递送（0.3 µL/孔）所需的转染试剂浓度稍高一些。

图 1.单次 Silencer Select siRNA 转染后的沉默持续时间。使用四种不同 Ambion Silencer Select 预设计 siRNA 以 5 nm 浓度转染 HeLa 细胞（500 个细胞/孔）。按照指示使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT™ 试剂盒在转染后第 1 至 10 天裂解细胞，并使用指定 TaqMan 基因表达检测试剂盒直接在细胞裂解物中进行实时 RT-PCR。相对于用 Ambion Silencer Select 阴性对照 #1 siRNA 转染的细胞的数据表示敲低数据。

不可以，将 siRNA 浓度从 5 nM 提高至 50 nM 并不会改善或延长沉默（图 2）。据推测，在 5 nM 下高效 siRNA 发生高效转染后 RISC 会达到饱和；过量的 siRNA 可能会快速降解、隔离或从细胞中排出。此结果与一项既往研究一致，该研究报告了 Silencer Select siRNA 在高 (100 nM) 和低 (3 nM) 浓度下的有效沉默（>80% 敲低）[1]。作者还进一步表明，降低 siRNA 浓度会减少对基因表达的脱靶效应，从而提高敲低特异性。

图 2.两种不同 siRNA 浓度下的 RNAi 效应的持续时间。如图 1 所示，在 5 nm 或 50 nm siRNA 浓度下使用相同的 Ambion Silencer Select 预设计 siRNA 转染 BJ 细胞（500 个细胞/孔）。按照图 1 所示测量敲低情况。

在某些情况下重复转染可延长沉默持续时间，但是我们发现该方法会带来不同的结果。图 3 显示，对于在 HeLa 细胞中检测的 4 种 siRNA 中的 3 种，与单次转染相比，在第 4 天添加第二次 siRNA 转染改善了第 6-11 天的敲低，尽管 4 种 siRNA 中只有一种实现 >70% 的敲低持续至第 14 天。在第一次转染后 24 小时进行第二次转染时，未发现 RNAi 效应的寿命显著延长（未显示数据）。结果表明，重复进行 siRNA 转染会改善第 6 天及之后某些 siRNA 的敲低，但敲低水平可能仅在极少数情况下达到第 2 天观察到的最高水平。

图 3.单次转染和双重转染后沉默的持续时间。使用四种独立 Ambion Silencer Select 预设计 siRNA (5 nM) 转染 BJ 细胞（500 个细胞/孔）。单次转染在第 0 天进行；双重转染在第 0 和 4 天进行（用箭头表示）。按照图 1 所示测量敲低情况。